CRISPR功能研究入门指南(CRISPRi)

【字体: 时间:2016年03月03日 来源:生物通

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  The Scientist杂志联合CRISPR的开发者和使用者共同编写了使用CRISPRa和CRISPRi的入门指南,帮助研究者们更好的研究和调节基因组的编码和非编码区域。

生物通报道:基因组测序让我们意识到,人类基因组只有一小部分被翻译成蛋白质。其实我们基因组的80%会转录成RNA,但这些转录本大多不生成蛋白质。近年来人们发现非编码RNA往往与人类疾病有关,不过绝大多数非编码RNA的功能还是未知的。

CRISPR/Cas9在这方面可以起到重要的作用。这一系统原本是细菌在漫长进化史中演化出的防御机制,能根据引导RNA的指示,靶标并降解入侵者的遗传物质。规律成簇的间隔短回文重复CRISPR与内切酶Cas9的组合,可以在引导RNA的指引下,靶标并切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点,将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。

CRISPR/Cas9很快迎来了进一步的改造。研究者们将Cas9带到特定的基因组位点,通过起始或停止转录来调控靶基因的表达。CRISPR激活(CRISPRa)和CRISPR抑制(CRISPRi)就是这样的技术,它们特别适合分析非编码RNA的具体功能。虽然越来越多的研究人员开始使用CRISPRa和CRISPRi,但它们其实还刚出炉不久?!拔颐嵌际钦庑┘际醯牟馐栽?,”加州大学的Jacob Corn说。

为此,The Scientist杂志联合CRISPR的开发者和使用者共同编写了使用CRISPRa和CRISPRi的入门指南,帮助研究者们更好的研究和调节基因组的编码和非编码区域。

CRISPRi

CRISPRi技术能抑制指定目标的转录,不论是编码还是非编码的DNA片段。CRISPRi使用催化失活的Cas9(dCas9),dCas9能到达引导RNA指定的位点,但无力对DNA进行剪切(Cell, 152:1173-83, 2013)。当dCas9结合到基因组的时候,会阻断转录机器的结合,阻止这一过程的进行。

改良版CRISPRi在dCas9上连接了一个来自转录沉默子(KRAB)的结构域。这个大约50aa的添加阻碍了DNA伸展,使其难以得到转录?!癒RAB结构域的使用目前效果很好,”Corn说。牛津大学的Andrew Bassett也同意这一看法,他认为刚开始接触CRISPRi的新手应该优先考虑KRAB。虽然它作用于比较大的位点,但抑制效果也更强,更容易被我们观察到。

CRISPRi的可逆性是一种特色,不过这也限制了该技术的应用。一些研究者正在利用KRAB结构域让dCas9结合得更加稳定,以实现永久抑制特定位点的转录。人们可以通过这种方法研究表观遗传学标记的跨代遗传,Corn指出。

RNAi VS CRISPRi

研究基因功能最常见的方法是,减少或者阻断基因表达,然后进行表型分析。十多年来,RNAi一直是这一领域的王者,然而新兴技术的涌现(尤其是CRISPR技术)正在逐渐瓦解RNAi的统治地位。日新月异的技术发展为生物学研究提供了越来越大的助力,也给研究者们带来了一个有些纠结的问题,“到底应该选择那一种技术呢”。

RNA干扰(RNAi)靶标成熟的RNA,而CRISPRi阻止转录的起始。如果你的研究核心是转录活动而不是RNA产物,那么CRISPRi更有优势。此外CRISPRi还可以靶标细胞核内的转录本,RNAi试剂则很难做到这一点。

RNAi的脱靶效应一直令人担忧。虽然CRISPR系统也存在脱靶效应,但要比RNAi少得多,因为CRISPRi必须在转录起始位点附近才能发挥作用。目前我们对RNAi的问题更为了解,Corn说,因此他的研究团队仍在使用RNAi。不过Corn相信RNAi未来难免会江河日下。

未完待续

Molecular Cell杂志技术特刊的一篇文章对RNAi、TALEN和CRISPR这三大工具进行了全面比较,为基因功能研究提供了一份实用指南。研究者们可以根据自己的需要,简单直观的找到最适合自己的技术。现在这篇文章可以免费下载(更多详细信息参见:CRISPR、RNAi、TALEN一张图教你做出正确选择

RNAi比较容易出现错误,siRNA/shRNA的脱靶效应会引起假阳性结果,siRNA/shRNA缺乏活性会引起假阴性结果。此前,加州大学旧金山分校的研究团队通过建立超复杂混合shRNA文库(ultracomplex pooled short-hairpin RNA libraries),在很大程度上克服了RNAi用于全基因组筛选时的脱靶效应。现在他们通过系统改良进一步增强了shRNA的活性,向人们展示了靶标人类和小鼠基因组的新一代shRNA文库。(更多详细信息参见:与CRISPR旗鼓相当的新一代RNAi

CRISPR-Cas9在医疗领域有着广阔的前景,可以用来矫正致病突变,治疗人类疾病。研究者们也在尝试用这一技术操纵生态群体,比如根据毒力或者抗性基因杀死相应的细菌、快速改变种群性状、控制入侵物种、改良主要农作物等等。此外,CRISPR-Cas9还有着很大的潜力,可以被改造为更强大的研究工具。加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna在Molecular Cell杂志上发表文章,全面探讨了CRISPR-Cas9在各方面的应用。Doudna是CRISPR技术的共同开发者,曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”(Breakthrough Prize),也是CRISPR专利的有力竞争者。(更多详细信息参见:CRISPR只是基因组编辑?你已经OUT了

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